SVAR:
1.a) Förslag: Gelfiltreringskromatografi, kommer att ge 4 baslinjeseparerade toppar.
Elueringsordning störst först, så topp 1 Protein E, topp 2 protein D, topp 3 protein C och B, topp 4
protein A. För att separera protein B och C, jonbyteskromatografi. Katjonbytare, proteinerna binds in vid
pH 6,5. Vid detta pH är protein B plusladdat och fastnar i kolonnen, protein C minusladdat och rinner
rakt igenom. För att eluera B höj jonstyrkan på bufferten. Kromatogrammet bör endast innehålla en
topp.
b) Har en reaktiv serin i aktiva ytan.
c) Kymotrypsin klyver C-terminalt om stora opolära sidokedjor. Peptiderna innehållande Phe och Trp kan
fungera som substrat.
d) Kortfattat svarsförslag för fullständigt se fig i Stryer. De 3 aa i aktiva ytan är: Asp, His och Ser. His
fungerar som protonrelä (omväxlande bas/syra). Initialt tar His en proton från Ser som då blir en bra
nukleofil. Asp håller His på plats och underlättar His roll som protonacceptor. Efter klyvning av
peptidbindninen donerar His en proton till aminogruppen. Under enzymregenereringsstegen av
katalysen fungerar His i tur och ordning som proton-acceptor och sedan donator.
2a) Approximationen innebär att [ES] är i det närmaste konstant under en viss tid då det fortfarande
finns ett överskott på S över E då gäller:
d ES
0 k1 E S k 2 ES k 1 ES
dt
b) kcat beskriver enzymets effektivitet och anger hur mycket substrat som omvandlas till produkt per
enzymenhet och per tidsenhet
c)
1
((l*min)/mmol)
v 0.45
0.4
Linjens ekvation y = 0.4062x + 0.1976
y = 0.4062x + 0.1976
0.35
0.3
Skärning med y-axel = 0.1976 = 1/vmax
Linjens lutning = 0.4062 = KM/vmax
0.25
Series1
0.2
Linear (Series1)
0.15
0.1
0.05
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
1
S
(mM-1)
Beräkna vmax: vmax = 1/0.1976 = 5.06 mmol/(l*min)
Beräkna KM: KM = vmax * 0.4062 = 5.06 * 0.4062 = 2.05 mM
e) Röd linje visar hur grafen
förändras i närvaro av en
nonkompetitiv inhibitor.
1
((l*min)/mmol)
v 0.45
KM påverkas inte
vmax minskar med faktorn
1+[I]/KI (där KI = [I][E]/[EI])
0.4
y = 0.4062x + 0.1976
0.35
0.3
0.25
Series1
0.2
Linear (Series1)
0.15
0.1
0.05
0
0
Linjen lutning (= KM/vmax) ökar i närvaro av inhibitorn
Skärningen med y-axeln (= 1/vmax) ökar i närvaro av inhibitorn
Skärningen med x-axeln (=-1/KM) förändras inte
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
1
S
(mM-1)
3. a) Fosfatgrupperna pekar utåt och kvävebaserna pekar inåt.
b) En fosfatgrupp kopplar två sockerenheter via ett syre på 3’-kolet och ett syre på 5’kolet där 3’betyder
kolatom nummer 3 i sockerenheten och 5’ betyder kolatom nummer 5 i sockerenheten.
c)
Ny trifosfatnukleotid binder först till mallkedjan genom basparning i.e. vätebindning mellan två
matchande kvävebaser
Hydroxylgruppen på C3 i den intilliggande nukleotiden gör en nukleofil attack på den innersta
fosfor-atomen i den nya trifosfatnukleotiden.
Pyrofosfat (PPi) hydrolyseras och den nya nukleotiden sätts ihop kovalent med resten av DNA
kedjan
Energikrävande process - energi frigörs då PPi hydrolyseras
d) Om ett fel uppstår vid replikationen och inte åtgärdas kommer felet att finnas kvar hos kommande
generationer av celler vilket kan resultera i permanenta fel vid syntes av proteiner. Ett fel vid
transkriptionen leder till ett felaktigt mRNA (och fel vid proteinsyntesen) men eftersom mRNA till slut
bryts ned (då proteinet inte längre skall syntetiseras) så blir felet inte permanent. DNA-polymeras I har
s.k. exonukleasfunktion och det innebär att den kan hydrolysera bort en felaktigt inkorporerad nukleotid.
e) Om RNA innehåller två efterföljande sekvenser med många G och C så kan dessa baspara med
varandra och bilda en stabil hårnålsloop (G och C basparar med tre vätebindningar). Om det sedan
kommer en sekvens på RNA som innehåller många U så sker en destabilisering i interaktionen mellan
RNA och DNA (U och A basparar med två vätebindningar) vilket leder till att RNA:t lossar från DNA och
RNA-polymeraset släpper.
Ett annat sätt att avsluta transkriptionen sker genom proteinet rho som känner igen en sekvens i det
nysyntetiserade transkriptet och binder till RNA:t vilket leder till att RNA-polymeraset lossnar. Processen
kräver energi (hydrolys av ATP → ADP + Pi).
4. a)
De primära mRNA transkripten i eukaryoter består av exoner och introner.
Exonerna innehåller den genetiska informationen som kodar för protein.
Intronerna används inte som mall för proteinsyntes utan dessa klipps bort från mRNA –
processen kallas för splicing.
Ofta kodar exonerna för olika funktionella domäner eller subenheter i ett protein.
Genom alternativ splicing kan olika varianter av mRNA bildas från en och samma kodande
region på DNA – detta gör att vi kan producera betydligt fler varianter av mRNA än det antal
gener vi har.
Ex. en gen som innehåller fyra exoner (nummer 1, 2, 3 och 4). Mellan exonerna finns introner.
När intronerna skall klippas bort från mRNA kan detta ske på olika (alternativa sätt) vilket
innebär att en eller flera exoner också tas bort. På så vis kan olika varianter av mRNA bildas (ex.
mRNA med exon 1, 2 och 4 eller mRNA med exon 1,3 och 4 osv).
b) Ett kodon är nukleotidtriplett i mRNA som kodar för en viss aminosyra vid proteinsyntesen.
Antikodonet är en nukleotidtriplett i tRNA som vätebinder komplementärt och antiparallellt till mRNA
vid proteinsyntesen. Gör att rätt aminosyra byggs in i proteinet.
c)
Vid start av translationen sitter en tRNA-molekyl med den växande polypeptidkedjan (eller fmet
vid första translationsrundan) i P-sitet.
En ny tRNA-molekyl med kopplad aminosyra binder in i A-sitet där det sker en matchning mellan
kodonet på mRNA i A-sitet och antikodonet på den inkomna tRNA-molekylen.
Den växande polypeptidkedjan (eller fmet) på tRNA:t som sitter i P-sitet överförs till aminosyran
i A-sitet och en ny peptidbindning bildas.
Därefter sker en translokering vilket innebär att den fria tRNA-molekylen i P-sitet flyttar till Esitet, tRNA som binder den växande polypeptidkedjan flyttar från A-sitet till P-sitet och mRNA
matas fram motsvarande en bastriplett så ett nytt kodon exponeras i A-sitet.
Den fria tRNA-molekylen lämnar E-sitet och en ny translationsrunda kan ske.
