Molekylär bioteknik
Föreläsning 1
Molekylär Bioteknik HT 2008
Molekylärbiologi
Biokemi
Mikrobiologi
Kemiteknik
Genetik
Molekylär
bioteknik
Transgena djur
Cellbiologi
Rekombinant proteinproduktion
-terapeutika
-diagnostik
-vaccin
-växter
-djur
Diagnostik
Förståelse av sjukdomar
-genetisk predisposition
-detektion av patogener
Förståelse av cellbiologi
-infektiösa: HIV, Hepatitis
-genetiska: cancer, Alzheimer, CF
-signalöverföring
-differentiering
-celldöd
Vad är en gen?
Prokaryot transkription/translation
RNA polymeras
gen
P
signalpeptid
transkriptionsstart
SD
SD
TAA
TAG
TGA
ATG
GTG
TTG
SD
RBS
SD
transkriptionsterminering
SD
promotorer
ribosomer
SD
polycistront mRNA
strukturell gen
transkriptionsenhet
SD
proteiner
-operon
-kopplad transkription/translation (cytopl.)
Eukaryot transkription/translation
exon
P
intron
SD
transkription
primärt mRNA
(monocistront)
cellkärnan
processning
5’Cap
AAAA
AAAA
translation
protein
• PCR
-restriktionsenzymer
-ligaser
-DNA-polymeraser
-omvänt transkriptas (RT)
-kinaser
-polynukleotidtransferaser
-fosfataser
• In vitro mutagenes-heat-shock
-primers
-prober
-gene assembly
AAAA
export
5’Cap
• Enzymer
• Oligonukleotidsyntes
splicing
5’Cap
Molekylärbiologiska verktygslådan
• DNA sekvenering
cytoplasman
-Maxam-Gilbert
-Sanger
-pyrosekvenering
• Vektorer
-plasmider
-fager (M13, )
-cosmider
-YACs
-virus
• Värdceller
-bakterier
-jäst/svampar
-växtceller
-insektsceller
-mammalieceller
• Transformering
-elektroporering
-partikelbombardemang
-mikroinjektion
-transfektering
• Selektionsmetoder
-antibiotika resistens
-genetisk komplementering
• Screeningmetoder
-genotypisk
-fenotypisk
1
Restriktionsenzymer
Kloning - Expression
• Specifika DNA-sekvenser (4-8bp) känns igen och klyvs av restriktionsenzymer
Enzymer
• Igenkänningssekvensen (RS) är ofta en palindrom, d v s kan läsas från båda håll
• Specifika metylaser metylerar baser i RS varmed bakteriens eget DNA skyddas
från klyvning
EcoRV
EcoRI
GATATC
CTATAG
GAT
CTA
PstI
GAATTC
CTTAAG
ATC
TAG
G
AATTC
G
CTTAA
CTGCAG
GACGTC
CTGCA
G
G
ACGTC
”sticky ends”
”blunt end”
Restriktionsenzymer
Restriktionsenzymer
Ligaser
DNA-polymeraser
• Ligaser återskapar fosfodiesterbindningar genom att 5’-fosfatgruppen förenas
med fria 3’-hydroxylgruppen. Ett vanligt använt ligas är T4-DNAligas.
• Ligaser används för att ”klistra ihop” DNA-fragment med varandra.
G-OH P-GATCC
CCTAG-P HO-G
+ T4-DNAligas, ATP
GGATCC
CCTAGG
kan återklyvas med BamHI
(5’-GˇGATCC-3’)
G-OH P-GATCT
CCTAG-P HO-A
+ T4-DNAligas, ATP
G GATCT
CCTAG A
• DNA-polymeraser inkorporerar deoxynukleotider (dNTPs) till en
växande DNA-kedja genom att addera dessa dNTPs till den fria 3’OH-gruppen på kedjan med motstående DNA-sträng som templat.
Några vanligt använda polymeraser är DNA-polymeras I samt T7DNA polymeras.
• De används bl a för att:
-generera blunt-ends
-vid sekvensreaktioner
G
CCATG
+ dNTPs, polymeras
GGTAC
CCATG
kan ej återklyvas med BamHI
(5’-GˇGATCC-3’)
2
Omvänt transkriptas (RT)
Terminaltransferas
• Omvänt transkriptas (RT) syntetiserar en komplementär DNAsträng utifrån ett RNA-templat. Retrovirus (ex HIV) använder
denna mekanism för att göra en DNA-kopia av sitt RNA-genom.
• Terminaltransferas adderar nukleotider till 3’-änden av DNAkedjor.
• De används bl a för att generera kohesiva ändar från blunt-end
fragment och vid cDNA-syntes.
• Tekniskt användningsområde:
-utnyttjas i ett steg då man vill göra cDNA.
5’
mRNA 5’Cap
dATP
AAAAA 3’
TTTTT 5’
5’
dTTP
terminaltransferas
omvänt transkriptas
+ dNTPs
3’
AA…AA-OH
5’
5’
HO-TT…TT
3’
mRNA 5’Cap
cDNA
3’
3’
+
3’
ligering
AAAAA 3’
TTTTT 5’
5’
AA…AA
3’
3’
TT…TT
5’
Fosfataser och kinaser
Kloning - Expression
• Fosfataser tar bort fria 5’-fosfatgrupper från DNA
-används för att minimera bakgrundsligering av självligerad vektor
vid kloningsförsök
-vanliga fosfataser är shrimp- samt bovine alkaline phosphatase
DNA- sekvenering
• Kinaser adderar fosfatgrupper till 5’ änden av DNA
-används för att fosforylera syntetiskt DNA (ex linkers) före
ligering till vektor
-polynukleotidkinas (PNK)
Maxam-Gilbert-sekvenering
1.
2.
3.
5’
3’
3’
5’
dubbelsträngat DNA
3’
märk med 32-P
3’
3’
3’
klyv med RE
preparera enkelsträngat
DNA
4.
5.
selektiv kemisk
degradering av
specifika baser
G
A+G T+C
C
6. G
A
+
G
T
+
C
Sanger-sekvenering
C
Sangers dideoxymetod
C
G
A
C
A
C
T
G
A
C
T
G
A
T
P
5’-märkt
oligonukleotid
P
P
O CH23
Bas
O
H
H
H
H
H
ssDNA
H
2’,3’-dideoxyanalog
+ DNA-polymeras
+ dNTPs
T C G A
+ ddATP
A
+ ddCTP
C
A
+ ddTTP
T
G
C
A
+ ddGTP
T
G
C
G
T
G
T
C
G
A
C
T
G
C
A
A
T
3
Pyrosekvenering
Kloning - Expression
Light intensity
is proportional
to the number
of nucleotides
incorporated
PCR
2xT
LIGHT
Photomultiplication
on CCD camera
A
CAT
Addition order
A T G C AT...
PCR (Polymerase chain reaction)
Kloning - Expression
94°C
DNA-templat
Mutagenes
94°C separation av DNA-strängarna
45-65°C
45-65°C annealing av specifika primers
72°C extension
(värmestabilt Taq polymerase)
72°C
Upprepa 25-40 cykler exponentiell ökning av mängden produkt
In vitro mutagenes
Riktad mutagenes
TTC
AAG
Exempel:
TTC TAC
Ser Tyr
Denaturera och hybridisera
med mutant oligonukleotid
TAC
AAG
Komplementära, syntetiska
oligonukleotider med den önskade
mutationen:
Riktad mutagenes
Slumpmässig mutagenes
Studera effekter av
enstaka mutationer
Screena/selektera för
intressanta mutationer
DNA-polymeras + DNAligas
TAC
AAG
TAC
TTC
AAG
TTC
Transformera bakterier
TTC
AAG
TAC
AAG
4
Plasmider
Kloning - Expression
• Plasmider är cirkulärt extrakromosomalt DNA
Vektorer
• De används som vektorer = bärare av främmande DNA
-utnyttjas för detta ändamål vid kloning och proteinexpression
-insert 5 kb
• Plasmidvektorer innehåller generellt:
-ori (origin of replication)
-gen/er för selektion (ofta antibiotikaresistens)
-multikloningssite
-ibland gen för screening (t ex lacZ för blå-vit screening)
• Olika typer av plasmidvektorer har olika ”copy nr”
• Plasmider tillhör olika inkompatibilitetsgrupper. Två olika
vektorer tillhörande samma inkompatibilitetsgrupp kan ej
propageras samtidigt i en och samma värdcell.
Bakteriofag Bakteriofag • Bakteriofag är ett virus som infekterar bakterier (E. coli).
-de kan ha en lytisk och en lysogen fas.
-de har ett genom om ca 45 kb, varav en central region,
omfattande ca 15 kb, ej behövs för dess replikation.
-i vardera ände av genomet finns enkelsträngade komplementära
kohesiva ändar (COS-sites). Dessa utnyttjar fagen för att göra
konkatamerer av sitt genom inför packning i fagpartiklar.
• -genomet har modifierats så att det passar som vektor. Bl a har
unika sites introducerat på vardera sida om den centrala regionen,
vilka kan utnyttjas för att ersätta denna med främmande DNA.
-insert måste ha en storlek om ca 15 kb, annars kan infektiösa
fagpartiklar ej packas.
• används för kloning av genomiska fragment, eftersom
plasmider inte lämpar sig som bärare av större fragment.
Cosmider
Yeast artificial chromosome (YAC)
• Cosmider är hybrider av plasmider och fager. De innehåller:
-ori
-gen för antibiotikaresistens (ex Tet)
-cos-sites
-kloningsites
• YACs innehåller:
-autonomously replicating sequence (ARS) från jästkromosom
-centromer (CEN), vilken bidrar till stabil fördelning av YACs
mellan moder- och dotterceller
-två telomerer, vilka fungerar som kromosomändar och därmed
möjliggör replikation av YACs i form av små linjära kromosomer.
-selekterbara markörgener, ex LEU2 vilken komplementerar Leunegativa stammar.
-kloningsites
• Cosmider utnyttjas för kloning av genomiskt DNA när större
fragment än 15 kb används (gränsen för vad lambda kan
härbärgera). De kan bära ca 45 kb insert.
cos
vektor DNA (cosmid)
• YACs används för kloning av mkt stora genomiska DNAfragment (100-2000 kb)
telomer
LEU2
ARS
CEN
jäst DNA
telomer
antibiotika-resistens
gen
genomiskt DNA
50 kb
5
Värdceller
Kloning - Expression
Värdceller
Olika vektorer används för att introducera rekombinant
DNA i olika typer av värdceller, t ex:
- E. coli är vanligast
- Höga expressionsnivåer
- Möjlighet till storskalig produktion.
• Bakterier
•
•
•
•
Jäst
Insektsceller
Däggdjursceller
Växtceller
Eukaryota celler
Post-translationella modifieringar
(t ex glykosylering) möjliga
Antibiotika-resistens
Kloning - Expression
Vanliga antibiotika inom molekylärbiologi:
Selektionsmetoder
-
ampicillin
carbenicillin
kloramfenikol
tetracyklin
kanamycin
Transformera bakterier
med ligerad plasmid
Kloning - Expression
Screeningmetoder
Klonad gen
Inhiberar syntes av cellväggen
Inhiberar proteinsyntes
Sprid ut bakterierna och
låt växa på agar-platta med
antibiotika
Gen för
antibiotikaresistens
Plasmid
Endast bakterier som tagit upp
plasmid med antibiotika-resistens
överlever och ger upphov till
kolonier
Genotypisk screening
• Probhybridisering
– känd nukleotidsekvens
• 15 nukleotiders prob
– okänd nukleotidsekvens
• guessmer, ca 50 nukleotider (unik)
Längre pga risk för mismatch
• degenererad prob, ca 17 nukleotider
baserad på aa-sekvens (6 st)
6
Fenotypisk screening
Blå-vit screening
EcoRI site
• Aktivitets-screening
LacZ
AmpR
– ex. proteasaktivitet (subtilisin)
• odling på kasein-medium
• klart område runt koloni
• Immunoscreening
Transformera bakterier och
odla på agar-plattor med
ampicillin och X-gal
– antikropp mot proteinet
H
N
OH
OH
O
H
OH
H
H
OH
O
Br
H
H
Cl
X-gal
Kloning av ett fragment i EcoRI
sitet förstör LacZ, som kodar för
enzymet -galaktosidas
- endast bakterier som har tagit upp
plasmid är resistenta mot ampicillin
och kan växa
- bakterier utan klonat fragment har
funktionellt -galaktosidas och bildar
en blå produkt av substratet X-gal
- bakterier med klonat fragment
saknar funktionellt -galaktosidas och
bildar vita kolonier
7
