SVARSFÖRSLAG: NKEC14 20080529
1.a) Alt 1. Först anjonbytare sedan kajonbytare
Alt 2. Enbart katjonbytare
Alt 3. Enbart anjonbytare
Detaljsvar alt.3:
Vid pH 8 är alla proteinerna – laddade och binder till en anjonbytare. Lämplig buffert,
Tris-HCl pH 8 med svag jonstyrka. Eluera genom att gradvis höja jonstyrkan eller sänka
pH. Proteinerna kommer att eluera efter respektive pI, dvs det med högst pI först och det
med lägst pI sist. + Kromatogram.
b) Hb finns i 2 former: R (hög syre affinitet) och T (låg syre affinitet). T formen
stabiliseras av 8 jonbindningar vilka saknas i R. Då syre binder till hemegruppen i Hb
förflyttas Fe in i hemeplanet och drar med sig en His (till vilken den är koordinerad).
Detta får till följd att en helix flyttar sig och jonbindningar mellan subenheterna bryts.
Jämvikten mellan T och R förskjunts mot R. Inbindningen av syre är kooperativ, dvs då
första syre bundit in lättare för nästa osv.
2.a) Alt 1: Kristallisera enzym-substratanalog komplex.
Alt2: Gruppspecifikt reagens, ex då reaktiv Ser i aktiva ytan kan DIPF användas.
Alt3: Affinitetsmärkning – substratanalog.
b) Ser-O- bättre nukleofil än vatten. NH2 bättre lämnande grupp an NH. + mekanism
c) CTP är en allosterisk inhibitor – feedback inhibering. Binder till regulatoriskt site.
ATCase finns i 2 former: R (aktiv) och T (inaktiv). CTP binder till T och stabiliserar
denna form. ATP är en allosterisk aktivator. Binder till samma site som CTP men
stabiliserar R formen.
3.a) Vmax 5,0 mM/min, KM 2,0 mM och kcat 625 min-1. + grafisk lösning
b) kcat/KM ~k1 dvs hur snabbt E och S kombineras.
kcat/KM = 5,2 x10-3 M-1 s-1 << 10 9 M-1 s-1
Fattas mycket för att bli perfekt.
c) strukturanalog, tex –OOC-CH2-CH2-COO4.a) Initiering: DNA lindas upp och RNA polymeras med sigma hittar promotorregionen,
sigma-subenheten släpper från RNA polymeraset.
Elongering: RNA polymeras tillverkar mRNA sträng med ena DNA strängen som mall
detta fortgår tills
Terminering: kan ske på 2 olika sätt rå-faktor oberoende, en stemloop struktur bildas av
en GC rik region följt av en AT rik region. Den AT rika regionen försvagar bindningen
av mRNA till DNA och mRNA lossnar. Rå-beroende: terminering sker mha av ett protein
som interagerar med mRNA och lossar det från DNA strängen.
b) Skillnader vi transkription är tex slicing av mRNA, poly-A svans respektive capping i
5´- änden (eukaryoter)
c) I lacoperonet är normalt genen avstängd då ett specifikt repressorprotein sitter bundet
vid operatorregionen och förhindrar RNA polymeras att läsa av genen. Vid induktion av
tex IPTG eller allolaktos sker en konformationsförändring av repressorproteinet som gör
att det inte kan binda till operatorregionen och därmed kan mRNA läsas av. Se fig 31.13 i
Stryer.
5.a) I-----------B------------------E--------------------------------------------------------------B---I
1000
2000
6500
500
B BamHI klyvningsite
E EcoRI klyvningssite
b) DNA detekteras med etidiumbromid som binder till DNA och vid belysning med UV
ljus kan DNA band ses.
c) Sangers dideoxysekvensning, de komponenter som behövs är primer, DNA polymeras,
ssDNA och ddNTP och dNTP, separation sker mha polyakrylamidgelelektrofores där
banden detekteras radioaktivt eller fluorescent (se fid 5.4 5.5 i Stryer)
6.a I ett cDNA bibliotek finns de gener som uttrycks i en specifik cell medan ett
genomiskt bibliotek innehåller allt DNA.
b) Komponenter som ingår, 2 st primers (forward och reverse) värmetåligt DNA
polymeras fria nukleotider och DNA. För beskrivning av tekniken se fig 5.8 Stryer.
c) Forward primer: 5´atggatggtacaagaacttc-3´ Tm = 56 (12x2 + 8x4)
Reverse primer: 5´aaaaacatgtcagtgtgsstttt-3´ Tm= 56 (16x2 + 6x4)
d) I en expressionsplasmid finns förutom Ori och antibiotika resistens även möjlighet att
klona in genen för att uttrycka proteinet.
