NGS i sjukvård
next generation sequencing
Jan Söderman
Medicinsk diagnostik
Länssjukhuset Ryhov
Jönköping
CREDIT: Peter & Maria Hoey / www.peterhoey.com
The ultimate genetic test, Science 336: 1110-1112, 2012
Varför NGS?
• Sjukdom & behandlingssvar påverkas av komplexa samband
Barrenas et al., PLoS One
4(11): e8090, 2009
Maiti & Nath, Autoimmun Rev. 2012 Sep 18., [Epub ahead of print]
Rossin et al., PLoS Genet
7(1): e1001273, 2011
Varför NGS?
celiaki
• Riskanlagsområden kan hysa flera
oberoende riskvarianter
Trynka et al., Nat Genet 43: 1193-201, 2011
• ”Klan-genomik” kan bidra till sjukdomsrisk, dvs
unika kombinationer av nyligen uppkomna,
ovanliga varianter kan vara kausala
Lupski et al., Cell 147: 32-43, 2011
Grundläggande flödesschema för NGS
Loman et al. Nat Biotechnol 30: 434-9, 2012
454 sequencing – Roche
Mardis ER, Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387-402, 2008
454 sequencing – Roche
Mardis ER, Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387-402, 2008
454 sequencing – Roche
Mardis ER, Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387-402, 2008
Mardis ER, Trends Genet 24: 133-41, 2008
Datakvalitet, mappning, alignment, variantanalys…
35 Mb – 600 Gb att analysera
NGS-tillämpningar
• Genom
• de novo sekvensering eller re-sekvensering av hela genom
• riktad sekvensering
• exome-sekvensering (kodande varianter / mutationer)
• djupsekvensering (ex. somatiska mutationer i ”cancer exoner”)
• identifiering av riskanlag i GWAS regioner
• Transkriptom
• genuttryck från hela genomet
• identifiering av transkriptvarianter
• identifiering av nya gener
• Metagenom
• extraktion och analys av DNA direkt från mikrobiella samhällen, ex.
tarmfloran
• Epigenom
• analys av protein-DNA interaktioner genom sekvensering av
immunoprecipiterat kromatin (ChIP-seq)
• sekvensering för metyleringsstatus
•…
NGS i sjukvården
Sequencing sets of genes is already being used to guide cancer treatment, and ...
Clinical sequencing programmes aimed at identifying the causes of rare genetic
diseases, mostly in children, are also being set up.
…so far, about half of the 10 patients who have come through his programme have
received a diagnosis.
Wayne Grody, medical director of UCLA's clinical sequencing programme
…which began offering clinical sequencing in 2009, says that a whole genome yields
a diagnosis in about 40% of cases.
In some instances, the diagnosis can lead to a treatment. … More often, she says,
sequencing reveals a rare and untreatable mutation.
Tina Hambuch, scientific liaison at Illumina
Hayden EC. Sequencing set to alter clinical landscape. Nature 482: 288, 2012
Pojke med aggressiv och behandlingsrefraktär
inflammatorisk tarmsjukdom
• Debuterar vid 15 månaders ålder med perianala abscesser & proktit, och som
utvecklas till att inkludera hela kolon, fistlar, sepsis, ileit…
• Olika kirurgiska & medicinska behandlingar under 3 års tid, utan att kunna
kontrollera sjukdomen.
• Misstänkt immunbrist, med påverkade immunologiska labb-värden. Inledande
genetiska tester dock normala.
• Övervägt allogens stamcellstransplantation (ASCT), men bedöms vara för sjuk och
säker diagnos saknas.
• Exome-NGS för diagnos. Letar lågfrekvent, recessiv mutation.
• Hittar 16 124 varianter (ca. 100 bedöms falska), varav 1 527 nya, och 7 158
påverkar proteinkodningen.
• 83 gener bar på homo- / hemizygota eller sammansatt heterozygota varianter som
bedömts skadliga med PolyPhen. Av dessa kvarstod XIAP (X kromosomal) som en
trolig kandidat efter ytterligare analys.
• Defekt XIAP ger ökad apoptos, & hög risk för död som följd av hemofagocyterande
lymfohistiocytos (& okontrollerad inflammation). Beslutsgrund för ASCT.
• Inga tecken på GI-symtom 5 månader efter ASCT.
Worthey et al., Genet Med 13: 255-62, 2011
APL med god chans till komplett remission eller
AML med riskcytogenetik
• Kvinna med misstänkt akut promyelocytleukemi (APL; PML-RARA fusion). Inleder
behandling med cytostatika & retinolsyra (god chans till komplett remission vid APL).
• Inledande behandling avbröts då cytogenetik / FISH inte kunde påvisa PML-RARA
fusion utan en ogynnsam cytogenetik för akut myeloisk leukemi (AML). Överväger ASCT.
• Helgenom NGS för att lösa problemet kring val av behandling. Inom en kliniskt relevant
tidsram (7 v) identifierades och validerades en klassisk PML-RARA fusion orsakad av en
insertion (istället för en translokation).
• Alternativa laboratoriemetoder hade kunnat användas, men dessa är arbetskrävande
och behöver designas för aktuella frågeställningar. Helgenom NGS är till designen
allmängiltig, och kunde även belysa cytogenetiken i övrigt. NGS & analys tog 25 dagar,
och valideringen 27 dagar (flaskhals).
Welch et al., JAMA 305: 1577-84, 2011
Diagnos av genetiska sjukdomar inom 50 h?
• Effektiv / delvis effektiv behandling finns för ~500 av ~3 500 genetiska sjukdomar med
känd orsak. För att vara kliniskt användbar behövs en snabb diagnostik vid neonatal-IVA.
• Differentialdiagnos inom 50 timmar med hjälp av helgenom NGS (~40x täckning).
• Avgränsning till ~600 sjukdomar med pediatriska symtom och etablerad genetik.
• Prioriterad genlista med hjälp av ett nytt verktyg för korrelation av kliniska data
och gener (SSAGA, symptom- and sign-assisted genome analysis).
• Automatiserad bioinformatik för base calling, alignment, variantdetektion &
prioritering av varianter (allelfrekvens & funktionell konsekvens).
• Retrospektivt bekräftades känd molekylär diagnos hos två barn
• Prospektivt erhölls:
• definitiv molekylär diagnos (utifrån prioriterad genlista) hos ett barn
• trolig molekylär diagnos hos två barn (fick leta utanför prioriterad genlista)
• ingen molekylär diagnos för ett barn
Saunders et al., Sci Transl Med 4: 154ra135, 2012
Dr. Stephen Kingsmore, Children’s Mercy Hospital and Clinics, www.youtube.com/watch?v=4IdnkDKE3Po
Tack!
